क्लिनिकल और प्रायोगिक नेत्र विज्ञान जर्नल
खुला एक्सेस

अमूर्त

रेटिना में एक नवीन जीन, फॉस्फोलिपेज़ डोमेन-कंटेनिंग 2 (Pnpla2) के वैकल्पिक रूप से विभाजित वेरिएंट की खोज

जैकलीन टालिया डेसजार्डिन, एस पेट्रीसिया बेसेरा और प्रीति सुब्रमण्यन

उद्देश्य: एनसेम्बल और अन्य एक्सप्रेस्ड सीक्वेंस टैग (ईएसटी) डेटाबेस माउस और चूहे में Pnpla2 के लिए संभावित वैकल्पिक स्प्लिस वेरिएंट का पता लगाते हैं , जो पिगमेंट एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक-रिसेप्टर (पीईडीएफ-आर) को एन्कोड करने वाला जीन है। इस अध्ययन का उद्देश्य माउस में Pnpla2 स्प्लिस वेरिएंट के लिए प्रायोगिक साक्ष्य प्राप्त करना था।

सामग्री और विधियाँ: फोटोरिसेप्टर (661W कोशिकाएँ) और माउस की आँख, हृदय, वसा, गुर्दे और यकृत के ऊतकों से प्राप्त माउस सेल लाइन की संस्कृतियों का उपयोग किया गया। मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) को कोशिकाओं और ऊतकों से अलग किया गया, और पूरक डीएनए (सीडीएनए) को संश्लेषित किया गया। पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्राइमर जोड़े को कथित स्प्लिस साइटों को फ़्लैंक करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। एक्सॉन एक्सक्लूज़न रियल टाइम पीसीआर का उपयोग पूर्ण-लंबाई वाले Pnpla2 ट्रांसक्रिप्ट के प्रवर्धन को कम करने और कम प्रचुर मात्रा में स्प्लिस वेरिएंट के प्रवर्धन को बढ़ाने के लिए किया गया था। पीसीआर उत्पादों को एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा हल किया गया और एक यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर के साथ पता लगाया गया। मानव पूर्ण-लंबाई वाले PNPLA2 cDNA या एक्सॉन 5b (E5b) की कमी वाले PNPLA2 cDNA वाले पुनः संयोजक प्लास्मिड तकनीकों को मान्य करने के लिए नियंत्रण थे। 661W कोशिकाओं से कुल सेल लाइसेट्स तैयार किए गए। वेस्टर्न ब्लॉट्स का उपयोग करके PEDF-R प्रोटीन का पता लगाया गया।

परिणाम: 661W कोशिकाओं या विभिन्न माउस ऊतकों से प्राप्त Pnpla2 प्रतिलेखों के लिए पीसीआर उत्पाद कई प्राइमर जोड़ों के साथ प्रवर्धन के बाद एकल बैंड में हल हो गए। विभिन्न मोलर अनुपातों पर दो PNPLA2 cDNA के एक साथ प्रवर्धन ने कम प्रचुर मात्रा में प्रतिलेखों का पता लगाने से रोका। हालाँकि, जब एक्सॉन बहिष्करण विधि का उपयोग करके पूर्ण लंबाई वाले Pnpla2 प्रतिलेख के लिए cDNA को महत्वपूर्ण रूप से बहिष्कृत किया गया था, तब भी Pnpla2 स्प्लिस वेरिएंट के अनुरूप कोई बैंड पता लगाने योग्य नहीं था। फिर भी, दो अलग-अलग एंटीबॉडी के साथ कुल 661W सेल लाइसेट्स के वेस्टर्न ब्लॉट्स ने PEDF-R प्रोटीन के लिए आइसोफॉर्म का पता लगाया।

निष्कर्ष: डेटा एक एकल, पूर्ण-लंबाई वाले Pnpla2 प्रतिलेख के अस्तित्व का साक्ष्य प्रदान करता है जो एकल प्रोटीन उत्पाद को जन्म दे सकता है जो अनुवादोत्तर प्रसंस्करण से गुजरता है।