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विवो में Ύ² 1-एड्रेनर्जिक रिसेप्टर फॉस्फोरिलीकरण अवस्था के निर्धारण की रणनीति

कोज़ो हयाशी और हिरोयुकी कोबायाशी

जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) सुपरफैमिली का एक सदस्य, β1-एड्रेनर्जिक रिसेप्टर (एडीआरबी1), हृदय समारोह का एक महत्वपूर्ण विनियामक है। सभी जीपीसीआर कई स्थानों पर फॉस्फोराइलेटेड होते हैं और फॉस्फोराइलेशन का विशिष्ट पैटर्न ऊतक-विशिष्ट तरीके से रिसेप्टर फ़ंक्शन और डाउनस्ट्रीम शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए "बारकोड" के रूप में कार्य करता है। हालांकि, विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी के कारण विवो में Adrb1 फॉस्फोराइलेशन साइटों के स्थान और कार्य के बारे में बहुत कम जानकारी है। इन विवो माउस हार्ट में Adrb1 की फॉस्फोराइलेशन अवस्थाओं और संबंधित कार्यों की पहचान करने के लिए पहले कदम के रूप में, हमने निम्नलिखित प्रयोगात्मक रणनीति विकसित की: 1) उन्नत फॉस्फोप्रोटिओमिक्स तकनीकों का उपयोग करके अलग-थलग किए गए माउस हार्ट में एगोनिस्ट-निर्भर Adrb1 फॉस्फोराइलेशन साइटों की पहचान; 2) Adrb1- ओवरएक्सप्रेसिंग HEK 293T कोशिकाओं से प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) डेटा द्वारा इन फॉस्फोराइलेशन साइटों का निश्चित असाइनमेंट; 3) जीवित जीव के भीतर फॉस्फोराइलेशन स्थिति को प्रकट करने के लिए इम्यूनोफिनिटी शुद्धिकरण के लिए N-टर्मिनस पर FLAG-टैग के साथ जुड़े Adrb1 को व्यक्त करने वाले नॉक-इन (KI) चूहों की पीढ़ी; 4) KI माउस हार्ट में Adrb1 के विशिष्ट साइट्स पर फॉस्फोराइलेशन स्तरों का स्पष्टीकरण फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड के MS माप से संबंधित अनफॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड आयन तीव्रता अनुपातों द्वारा। इस रणनीति का उपयोग करते हुए, हमने परफ्यूज़ किए गए माउस हार्ट में एगोनिस्ट-निर्भर फॉस्फोराइलेशन साइट के रूप में Adrb1 के C-टर्मिनस पर Ser462 की पहचान की। हमने KI चूहों में Ser274 (0.25), Ser417 (0.55) और Ser462 (0.0023) पर बेसल फॉस्फोराइलेशन अनुपात का भी खुलासा किया। ये निष्कर्ष साइट-विशिष्ट फॉस्फोराइलेशन द्वारा मध्यस्थता वाले Adrb1 फ़ंक्शन के विनियामक तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।