आईएसएसएन: 2456-3102
वादिम टिमरबाएव, सेर्गेई डोलगोव और तात्याना मिटिओचकिना
आनुवंशिक रूप से विकसित पौधों की प्रजातियों की संख्या में वृद्धि और उनकी स्पष्ट मौद्रिक व्यावहारिकता के बावजूद, ऐसी फसलों को समाज द्वारा ध्यानपूर्वक स्वीकार किया जाता है, मुख्य रूप से ट्रांसजेनिक पौधों में लक्ष्य गुणों की घोषणा के लिए और एंटी-टॉक्सिन और शाकनाशियों से सुरक्षा के विशेष मार्करों के रूप में दूरस्थ जीवन रूपों (सूक्ष्मजीवों, संक्रमणों, आदि) से बाहरी आनुवंशिक सामग्री की उपस्थिति के कारण। इन परिस्थितियों में विशेष रूप से उन प्रक्रियाओं को प्राथमिकता दी जाती है जिनके द्वारा बाहरी आनुवंशिक सामग्री के बिना, मुख्य रूप से जीवाणु मूल के, और एंटी-इंफेक्शन प्रतिरोध के गुणों के बिना नई अत्यधिक लाभकारी फसलें बनाई जा सकती हैं, जिनकी अनुपस्थिति में आनुवंशिक रूप से समायोजित जीवों को खुले ढांचे में छोड़ने की संभावना है, खासकर यूरोपीय संघ जैसे जीएमओ से संबंधित संदेह वाले क्षेत्रों में।
चूंकि मार्कर रहित जीवों को प्राप्त करने की तकनीकों ने पिछले दशक में ही असाधारण महत्व प्राप्त किया है, इसलिए अधिकांश अध्ययन नई तकनीकों और वेक्टर ढांचे के विकास पर केंद्रित हैं। इस कार्य में, परेशान करने वाले डीएनए को हटाने के लिए हमने pMF वेक्टर (प्लांट रिसर्च इंटरनेशनल, वैगनिंगन, नीदरलैंड) (शार्ट एट अल., 2004) से संबंधित एक साइट-विशिष्ट रीकॉम्बिनेज का उपयोग किया। इस ढांचे का मुख्य लाभ इसकी क्रमिक दोहरी पसंद है। एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थ परिवर्तन के बाद प्राथमिक चरण एंटी-माइक्रोबियल जैसे कि कैनामाइसिन, हाइग्रोमाइसिन या फॉस्फिनोट्रिसिन का उपयोग करके पुनर्योजी पदार्थों का निर्धारण करना है, और डीएनए समूहों का आगे निपटान, निर्दोष पुनर्संयोजन स्थलों (RS) से घिरा हुआ है, जो ग्लूकोकॉर्टिकॉइड रिसेप्टर के लिगैंड-प्रतिबंधित क्षेत्र (LBD) की दृष्टि में निष्क्रिय किए गए रीकॉम्बिनेज R के संयोजन आरंभ के कारण होता है। इसका क्रियान्वयन डेक्सामेथासोन (डेक्स) के घोल में पौधे के ऊतकों को भिगोने के बाद पूरा होता है। 5-फ्लूरोसाइटोसिन (5-एफसी) वाले माध्यम पर आगे का चयन सीओडीए गुणवत्ता वाले पौधे के ऊतकों के विकास को रोकता है (साइटोसिन डेमिनेज गैर-विषाक्त 5-एफसी को साइटोटॉक्सिक 5-फ्लूरोरासिल में बदल देता है)।
आनुवंशिक रूप से परिवर्तित पौधों में मार्कर गुणों, विशेष रूप से रोगाणुरोधी प्रतिरोध की उपस्थिति, पृथ्वी और मानव स्वास्थ्य के लिए खतरों से संबंधित आशंकाओं के कारण लोगों की नज़र में चिंता का विषय है। ट्रांसजेनिक पौधों का निर्माण जिसमें बाहरी आनुवंशिक सामग्री, विशेष रूप से जीवाणु और वायरल जड़ नहीं होती है, तनाव को काफी हद तक कम करता है। यहाँ हमने Z. rouxii recombinase R और CodA-nptII द्विक्रियात्मक चयनात्मक गुण युक्त pMF ढांचे का उपयोग किया है, जो बिना मार्कर वाले ट्रांसजेनिक टमाटर और सेब के पौधों के उत्पादन के लिए है, जो उष्णकटिबंधीय पौधे Thaumatococcus daniellii से बहुत मीठा thaumatinII गुण प्रदान करता है, जो E8 गुणवत्ता वाले प्राकृतिक उत्पाद विशिष्ट विज्ञापक और rbsS3A एलिमिनेटर से समतल किया गया है। हमने दो अलग-अलग रीकॉम्बिनेज नामांकन का उपयोग किया।
आवश्यक कॉलस का प्रारंभिक चयन और 5-एफसी मीडिया पर आगे के चयन के साथ ट्रांसजेनिक पौधों की पत्तियों या पेटीओल्स के डेक्सामेटासोन उपचार को स्थगित कर दिया। वैकल्पिक रूप से हमने वेक्टर द्वारा पौधों को बदला, बिना किसी विशिष्ट मार्कर के केवल थाउमैटिन आर्टिक्यूलेशन टेप को पहुंचाया। इस स्थिति के लिए ट्रांसजीन को सभी प्राप्त पुनर्योजी की पीसीआर जांच द्वारा चुना गया था। हमने टमाटर की 170 ट्रांसजेनिक लाइनें प्राप्त की हैं जिन्हें पीसीआर द्वारा पूरी तरह से विच्छेदित किया गया है। रीकॉम्बिनेज आंदोलन की स्वीकृति के बाद केवल एक पूरी तरह से मार्कर रहित ट्रांसजेनिक टमाटर लाइन प्राप्त हुई। तुलनात्मक परिणाम प्रारंभिक निर्धारण द्वारा प्राप्त किए गए थे। थाउमैटिन II टेप द्वारा प्रत्यक्ष परिवर्तन से दो मार्कर मुक्त पौधे भी आए। हम अनुशंसा करते हैं कि विभिन्न और असामान्य या अपूर्ण टी-डीएनए समावेशन की उपस्थिति के कारण एक खंडित निष्कर्षण और गुणसूत्र संशोधन सरल परिवर्तन टमाटर के पौधों के विभिन्न उदाहरणों में होते हैं।
हमें सेब की तीन मुक्त ट्रांसजेनिक लाइनें भी मिली हैं, जिन्हें टी-डीएनए अनुक्रमों की उपस्थिति के लिए पीसीआर द्वारा पूरी तरह से विच्छेदित किया गया है। हमने तब मार्कर रहित पौधों के चयन के लिए विलंबित पद्धति का उपयोग किया, जिसमें एक जाँच की गई लाइन में आर्टिक्यूलेशन टेप के सभी टुकड़े शामिल थे। रीकॉम्बिनेज आंदोलन की स्वीकृति के बाद हमें 30 से अधिक सबलाइनें मिलीं, उनमें से अधिकांश ने कैनामाइसिन से अपनी सुरक्षा खो दी। पीसीआर और दक्षिणी स्मीयर परीक्षा ने खुलासा किया कि आरएस गंतव्यों के बीच सभी दुर्भाग्यपूर्ण गुणवत्ता और व्यवस्थाएं पुनर्संयोजन प्रक्रिया द्वारा हटा दी गईं, जबकि प्रशासनिक घटकों के साथ उत्साह की गुणवत्ता पूरी तरह से प्राप्त पौधों में मौजूद है। वैसे भी अर्ध-मात्रा पीसीआर परीक्षा द्वारा हम अधिकांश में थ्यूमैटिन गुणवत्ता की अभिव्यक्ति को पहचान सकते हैं, लेकिन सभी सबलाइनों में नहीं। प्रारंभिक निर्धारण प्रणाली के रूप में तत्काल परिवर्तन उत्पादन मार्कर मुक्त सेब के पौधों के लिए अप्रभावी था। पीएमएफ प्रणाली मार्कर रहित सेब या अन्य जिद्दी फसलों के उत्पादन के लिए उचित है, क्योंकि सिजेनिक टमाटर के पौधों को रुचि की गुणवत्ता द्वारा सीधे परिवर्तन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इस अध्ययन को कुछ हद तक रूसी विज्ञान फाउंडेशन के अनुसंधान पुरस्कार संख्या 14-50-00079 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।