एंटीवायरल और एंटीरेट्रोवाइरल जर्नल
खुला एक्सेस

अमूर्त

स्तनधारी कोशिका-पंक्ति के भीतर पूर्ण लंबाई और बाह्यकोशिकीय डोमेन ईबीओवी ग्लाइकोप्रोटीन के पुनः संयोजक रूपों की क्लोनिंग, अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

मिसाकी वेएनगेरा, पीस बबिरिये, कैरल मुसुबिका, सैमुअल किरिमुंडा, मोसेस एल. जोलोबा

पृष्ठभूमि: पूर्ण लंबाई वाला इबोलावायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) स्पाइक्स बनाने के लिए सबसे बाहरी लिपिड झिल्ली को फैलाता है, जहाँ यह वायरस-होस्ट सेल इंटरैक्शन की मध्यस्थता करता है। जीपी (एसजीपी) का एक स्रावी रूप भी सभी 5 ज्ञात इबोलावायरस प्रजातियों द्वारा निर्मित होता है। ये विशेषताएँ जीपी को इबोलावायरस और संभवतः पैन-फिलोवायरस लक्षित रैपिड डायग्नोस्टिक टेस्ट (आरडीटी), जैव-चिकित्सा और टीकों के अनुसंधान और विकास (आर एंड डी) के लिए एक आदर्श लक्ष्य बनाती हैं। पुनः संयोजक ज़ैरे इबोलावायरस ( ईबीओवी ) जीपी की पिछली क्लोनिंग में मुख्य रूप से कीट ( बैकुलोवायरस ) अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग किया गया है। हम स्तनधारी कोशिका-पंक्ति में पुनः संयोजक ईबीओवी जीपी के पूर्ण लंबाई और बाह्यकोशिकीय डोमेन (ईसीडी) रूपों की क्लोनिंग, अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण की रिपोर्ट करते हैं।

विधियाँ और परिणाम: EBOV GP के पूर्ण लंबाई और ECD रूपों के 669 और 643 अमीनो एसिड (aa) अवशेषों के अनुरूप 2034 और 1956 बेस-पेयर (bp) कोडिंग DNA अनुक्रमों को pTGE प्लास्मिड में उप-क्लोन किया गया। पुनः संयोजक pTGE-प्लास्मिड का उपयोग सीरम-मुक्त FreeStyleTM 293 अभिव्यक्ति माध्यम में विकसित 293-6E HEK स्तनधारी कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए किया गया था। शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करने के लिए सेल लाइसेट्स और या कल्चर सुपरनैटेंट्स का उपयोग किया गया, इसके बाद SDS-PAGE और वेस्टर्न ब्लॉट पर विश्लेषण किया गया। वेस्टर्न ब्लॉट पर ~100 kDa (Cal.MW~71.67 kDa) के अनुमानित आणविक भार के साथ सेल लाइसेट्स में झिल्ली से बंधे प्रोटीन के रूप में शुद्ध पूर्ण लंबाई GP का पता चला; और 0.02 mg GP (सांद्रता: 0.2 mg/mL, शुद्धता: ~50%) व्युत्पन्न हुआ। इसके विपरीत, एसडीएस-पीएजीई और वेस्टर्न ब्लॉट के आधार पर अनुमानित आणविक भार ~ 116 केडीए के साथ सेल कल्चर ब्रॉथ के सुपरनैटेंट्स में ईसीडी जीपी का पता लगाया गया; और जीपी_ईसीडी की 1.6 मिलीग्राम (सांद्रता: 0.4 मिलीग्राम/एमएल, शुद्धता: ~ 70%) प्राप्त की गई।

निष्कर्ष: स्तनधारी कोशिकाओं के भीतर, पुनः संयोजक पूर्ण लंबाई वाले EBOV GP को मुख्य रूप से ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन (tGP) के रूप में व्यक्त किया जाता है, जबकि ECD GP को कल्चर माध्यम में निकाला जाता है। GP के दोनों पुनः संयोजक रूप तीव्र निदान परीक्षणों (RDTs) के अनुसंधान और विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं।