क्लिनिकल और प्रायोगिक नेत्र विज्ञान जर्नल
खुला एक्सेस

अमूर्त

थर्मल डिनेचुरेशन के बाद और कॉन्टैक्ट लेंस एक्सट्रैक्ट्स में लाइसोजाइम का मूल्यांकन करने के लिए एम्पलीफाइड क्रोमैटोग्राफिक सिग्नल और यूवी-अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी

क्लाउड जे गियासन, डेनिएल बेलैंड और लैंगिस माइकॉड

उद्देश्य: उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा मापे गए कॉन्टैक्ट लेंस से निकाले गए लाइसोजाइम से संबंधित अवशोषण संकेत को बढ़ाना; लाइसोजाइम की शुद्धता की जांच करना और यह देखना कि थर्मल विकृतीकरण इसके निक्षालन प्रोफाइल को कितना प्रभावित करता है।
तरीके: परीक्षण क्रोमैटोग्राफिक रन के दौरान, जिसके दौरान कॉन्टैक्ट लेंस के अर्क को सिस्टम में इंजेक्ट किया गया था, 4 से 5.5 मिनट के बीच एकत्र किए गए अंशों ने वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा इंगित किए गए निक्षालन प्रोटीन के रूप में लाइसोजाइम की ओर इशारा किया। 0.2% ट्राइफ्लुओरोएसेटिक एसिड (टीएफए): एसिटोनिट्राइल (एसीएन) के 50:50 घोल में कॉन्टैक्ट लेंस से प्रोटीन निकाले गए। प्रत्येक कॉन्टैक्ट लेंस के अर्क को 2 एलिक्वॉट में अलग किया गया 220 एनएम पर अवशोषण संकेत के अंशांकन ने क्रोमैटोग्राम में लाइसोजाइम के स्तर को मापने की अनुमति दी। HPLC में दोनों एलिकोट्स के समानांतर इंजेक्शन ने उनके लाइसोजाइम सामग्री की तुलना करने की अनुमति दी। निकाले गए लाइसोजाइम की शुद्धता का मूल्यांकन चोटियों में इसके अवशोषण स्पेक्ट्रम को देखकर किया गया। पहले 80 और 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किए गए लाइसोजाइम घोल को इंजेक्ट किया गया और नियंत्रण घोल के साथ तुलना की गई। एलिकोट्स नंबर 1 और 2 के बीच औसत लाइसोजाइम सामग्री में अंतर और नियंत्रण की तुलना में गर्म किए गए लाइसोजाइम के शिखर क्षेत्र में गैर-पैरामीट्रिक तरीकों से परीक्षण किया गया।
परिणाम: समृद्ध और नियमित अर्क में मापा गया औसत लाइसोजाइम स्तर काफी भिन्न था (क्रमशः 39.8 और 21.5 μg)। हालांकि, एक बार अलग इंजेक्शन वॉल्यूम और सांद्रता कारक के लिए सही होने के बाद, औसत समृद्ध लाइसोजाइम स्तर (21.4 μg) नियमित अर्क में पाए गए स्तर के करीब था। वर्णक्रमीय अवशोषण के अवलोकन से पता चलता है कि निस्तारित लाइसोजाइम संदूषकों से मुक्त है। नियंत्रित लाइसोजाइम के शिखर क्षेत्र पर गर्म लाइसोजाइम के शिखर क्षेत्रों का औसत अनुपात 100 डिग्री सेल्सियस (0.91) के तापमान पर 1 से काफी भिन्न था, लेकिन हस्ताक्षरित रैंक परीक्षण के साथ 80 डिग्री सेल्सियस (0.95) के तापमान पर नहीं। 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किए जाने पर भी, नियंत्रण की तुलना में लाइसोजाइम का निस्तारण प्रोफ़ाइल कम सममित दिखाई दिया और एक अतिरिक्त विभक्ति बिंदु प्रस्तुत किया। ये सूक्ष्म परिवर्तन 100 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ गए।
निष्कर्ष: संपर्क लेंस से निकाले गए लाइसोजाइम का संवर्धन और प्रारंभिक मोबाइल चरण में घुलनशीलता इस क्रोमैटोग्राफिक प्रक्रिया की संवेदनशीलता में सुधार करती है। यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ युग्मित यह क्रोमैटोग्राफिक प्रोटोकॉल 80 और 100 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल विकृतीकरण का पता लगा सकता है।