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डिस्ट्रोफिन के लिए जीन कोडिंग में विशिष्ट बिंदु उत्परिवर्तन को शामिल करने का एक नया तरीका: प्राइम एडिटिंग तकनीक।

सेड्रिक हैप्पी मबाकम

डिस्ट्रोफिन जीन में उत्परिवर्तन से न्यूरोमस्कुलर विकार जैसे ड्यूचेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी होती है जो एक घातक एक्स-लिंक्ड वंशानुगत बीमारी है जो 19.8 प्रति 100000 पुरुषों के जन्म के साथ होती है। कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स या मॉर्फोलिनो एंटीसेंस ऑलिगोमर इंजेक्शन के साथ वर्तमान में उपलब्ध नैदानिक ​​उपचार सीमित फेनोटाइपिक सुधार प्रदान करते हैं। हमारे अध्ययन का उद्देश्य प्राइम एडिटिंग तकनीक की दक्षता को मापना था। यह तकनीक मोलोनीमुरीन ल्यूकेमिया वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के लिए कोडिंग करने वाले प्राइम एडिटर प्लास्मिड (PE2 या PE3) का उपयोग करती है जो Cas9H840A निकेज के साथ जुड़ा हुआ है, और एक प्लास्मिड जो प्राइमर बाइंडिंग साइट्स (PBS) और एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस टेम्पलेट (RTT) युक्त pegRNA के लिए कोडिंग करता है। यह जीनोम में विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन, विलोपन या सम्मिलन की अनुमति देता है। हमने कई hDMD एक्सॉन (9, 20, 35,43, 51, 55, और 61) को लक्षित करके अलग-अलग pegRNA डिज़ाइन किए हैं, ताकि एक एकल न्यूक्लियोटाइड को संशोधित करके STOP कोडन पेश किया जा सके। HEK293T कोशिकाओं को PE2 और pegRNA के साथ एक साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए जाने के तीन दिन बाद DMEM कल्चर मीडिया से काटा गया। एक्सॉन को PCR एम्पलीफाइड किया गया और सेंगर विधि का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया। संपादन प्रतिशत का अनुमान लगाने के लिए EditR प्रोग्राम का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण किया गया। हमने पुष्टि की कि PRIME संपादन DMD जीन में विशिष्ट C से T और G से T प्रतिस्थापन की अनुमति देता है, जिसकी संपादन दक्षता 6 से 11% (PE2) और 21% (PE3) के बीच है। पहले के 6 दिन बाद दोहराए गए ट्रांसफ़ेक्शन ने एक्सॉन 9 और 35 में 15% (PE2) संस्करण दिखाया। PAM अनुक्रम (एक्सॉन 35) में एक अतिरिक्त उत्परिवर्तन ने एकल ट्रांसफ़ेक्शन के लिए PE2 परिणाम को 38% तक सुधार दिया। इस प्रकार, PRIME संपादन DMD जीन में विशिष्ट प्रतिस्थापन की अनुमति देता है और इसका उपयोग DMD जीन में बिंदु उत्परिवर्तन को ठीक करने के लिए किया जा सकता है जिससे डिस्ट्रोफ़िन अभिव्यक्ति हो सकती है।